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簕菜茶对亚硝化反应清除及阻断作用的研究

发布时间:2015-06-17 08:46          信息来源:

簕菜茶提取液对亚硝化反应清除和阻断作用的研究

张成1兰阳*2袁麒1朱科谕1叶慧颖1王应江1颜亨梅*1

(1北京师范大学珠海分校工程技术学院生物工程系,广东 珠海519087;2贵州省人民医院护士学校,贵州,贵阳550001)

摘要:本文以水、50%乙醇、50%甲醇作为提取剂,对簕菜茶中的活性物质进行提取,通过采用L9(34)正交试验法提取簕菜茶中的活性成分,确定出最佳提取条件;在模拟人体胃液环境条件下(pH3.0),采用了比色法和紫外光解法分别测定了簕菜茶提取液对亚硝酸纳的清除作用和对N-二甲亚硝胺(NDMA)体外合成的阻断作用。结果表明:从簕菜茶中提取抗亚硝化反应活性成分的最佳提取工艺条件为:以蒸馏水为溶剂,料液比(W/g:V/mL)为1(干燥簕菜茶):25(蒸馏水),沸腾水浴回流2.0h,此簕菜茶提取液对亚硝酸钠的清除作用可达75.04%,对亚硝胺合成的阻断率可达88.65%。同时比较了簕菜茶提取液清除亚硝酸根及阻断亚硝胺合成的能力。

关键词:簕菜茶浸提液 阻断 清除 亚硝酸钠N-亚硝基化合物

中图分类号:O623.54;Q946;S661.9 文献标识码:A

Study on scavenging and disconnecting effect of Nitrosation Reaction by extracts ofAcanthopanax trifoliatus(Arallaceae) Tea

ZHANG Cheng1Lan Yang*2Yuan Qi1ZhuKe-yu1 Ye Hui-ying1Wang Ying-jiang1Yan Heng-mei*1

(1Department of Bioengineering,School of Engineering Technology,Beijing Normal University,zhuhai,519087; 2 Guizhou Province People's Hospital School for Nurses,550001,P.R. China)

Abstract:The purpose of this paper was to investigate the effect ofAcanthopanax trifoliatusTea bud extraction to scavenging nitrite and inhibiting the formation of N-nitrosodimethylamin(NDMA) in vitro.The active substance fromAcanthopanax trifoliatusTea was extracted through different solvents such as distilled water,50% ethanol and 50% methanol.The optimum extraction conditions were obtained by L9(34)orthogonal test: the ratio (W/g:V/mL)of solid(Acanthopanax trifoliatustea)to solution(distilled water) was 1:25,the extraction was proceeded for two hours used refluxing. Under those conditions,the maximum capacity of scavenging effect to sodium nitrite was 75.04%; the maximum capacity of inhibit the N-dimethylnitrosamine was 88.65%.And the inhibition capability of extract to nitrosamine ethylamine and scavenging sodium nitrite capability was compared.

N-亚硝基化合物在自然界中广泛存在,人们主要通过饮食、饮水等途径吸收进入人体,迄今为止,已发现的N-亚硝基化合物有300多种,其中90%以上可诱发人和动物的突变、致畸、致癌作用[1]。N-亚硝基化合物的前体物硝酸盐、亚硝酸盐和胺类广泛存在或产生于食物及其体内代谢产物中于食物以及产生于食物在体内的代谢中,硝酸盐或亚硝酸盐和胺类可以在体内外合成亚硝胺,尤其在胃液中更易合成[2-3]。因此清除亚硝酸盐是有效防止N-亚硝基化合物致癌的途径之一。如何阻止亚硝酸盐和亚硝胺此类物质的摄入,是国内外普遍关注的课题[4]。离体实验证实天然植物[5]、蔬菜汁[6]、杜仲[7]、榴莲壳[8]、琯溪蜜柚[9]等能有效阻断亚硝胺类的合成。

流行病学调查表明,胃癌的发生率与新鲜蔬菜,茶叶的摄人量成负相关[10]。簕菜学名三加皮(Acanthopanax trifoliatus )是五加科五加属植物。簕菜茶既是茶也是菜。凤凰茶中含有茶多酚、Vc[11]等生理活性物质及营养成分,茶多酚(TP)是一种高效的天然自由基清除剂,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、防癌、抗癌和延缓衰老等功效[12]。故此本文在体外模拟人体胃液的条件下,通过正交试验找出簕菜茶提取物中抑制亚硝化反应的活性物质的最佳提取工艺,研究簕菜茶提取物清除亚硝酸钠和阻断亚硝胺合成的能力,为簕菜茶的合理利用提供一定的科学依据。

 

1材料与方法  

1.1材料与仪器

簕菜茶 广东恩平响山茶厂生产,真空包装100g;甲醇 广州化学试剂厂;无水乙醇 广州化学试剂厂;柠檬酸钠 天津市大茂化学试剂厂;亚硝酸钠 天津市大茂化学试剂厂;二甲胺溶液 上海三爱思试剂有限公司;碳酸钠 广东光华化学厂有限公司;α-萘胺 天津市福晨化学试剂;对氨基苯磺酸 成都西亚化工股份有限公司;N-1-萘乙二胺盐酸盐 天津市永大化学试剂有限公司;聚酰胺粉(100-200目) 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂等试剂均为分析纯。

JJ500型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;UV752型紫外可见分光光度计 Phenix凤凰;ZF-I三用型紫外分析仪 上海顾村电光仪器厂;SHZ-D(III)型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;PB-10型pH精密酸度计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;EPED-T/D型实验室级超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司;冷凝回流装置等。  

1.2实验方法

1.2.1簕菜茶浸提液提取的单因素实验  

以广东恩平产簕菜茶为实验材料,分别以浸提剂种类、浸提时间、料液比、水浴温度进行单因素实验。以簕菜茶浸提液对亚硝酸根的消除能力作为考察指标,所有实验均重复三次。

1.2.2最佳浸提条件

为了系统考察簕菜茶抑制亚硝化反应最佳浸提工艺条件,选取了L9(34)正交表进行试验,选取的因素及水平如表1所示。分别以对亚硝酸钠清除率以及对NDMA合成的阻断率作为考察指标,通过正交实验所得的结果,通过极差分析从而确定理论上获得的最佳浸提工艺条件,随后通过实验进一步验证由理论计算所确定的最佳浸提工艺条件是否与实验结果相一致,从而最终确认簕菜茶活性物质最佳浸提条件。

表1 正交试验因素-水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

水平

因 素

A浸提剂

B浸提时间

( h )

C浸提温度(℃)

D料液比

(W/g:V/mL)

1

蒸馏水

1.0

90

1:25

2

50%甲醇

1.5

80

1:50

3

50%乙醇

2.0

100

1:75

1.2.3亚硝酸盐清除率的测定[13-14]

基本原理:亚硝酸盐在弱酸性的条件下,能与氨基苯磺酸重氮化后,再与N -1-萘乙二胺盐酸盐偶合生成红色化合物。

取簕菜茶浸提液2.0mL于25mL比色管中,加入12.5 mLpH3.0的柠檬酸钠盐酸缓冲液,再加入100mg/ kgNaNO2溶液2.5mL,用蒸馏水定容至刻度,37℃恒温2.0h,然后各吸取1.0mL反应液于小试管中,加入0.4%(质量分数)对氨基苯磺溶液2.0mL,0.2%(质量分数)N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液2.0mL,摇匀放置15min后,用紫外-可见分光光度计在波长为540nm处测吸光度值,分别用相应浓度相同用量的浸提剂作空白对照,最后计算清除率。

清除率= (A0- AX) / A0

A0——加入相应浸提剂空白实验的吸光度值

AX——加入不同浓度浸提液时的吸光度值

按上述方法,另分别取最佳浸提工艺条件下获得的簕菜茶浸提液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL进行对亚硝酸盐清除率的浓度梯度测定,计算每一浓度下的清除率。

1.2.4N-亚硝基化合物合成阻断率的测定[8-13]  

在模拟人体胃液的条件下,二甲胺与亚硝酸钠在37℃、pH3.0条件下,可适宜地生成二甲基亚硝胺(NDMA),反应式如下:

当向簕菜茶浸提液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时,浸提液中的活性物质先于二甲胺同亚硝酸钠作用,达到阻止NDMA生成的目的。据此可以比较相同条件下生成NDMA的多少来反映浸提液阻断能力的强弱,生成NDMA量少,浸提液的阻断能力就强,反之则弱。

在紫外光照射下,NDMA可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根,反应式如下:

亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后,再与α-萘胺偶合生成红色化合物。用分光光度计测出该化合物的吸光度值可计算上述反应液中NDMA含量的多少。

取浸提液2.0mL于25mL比色管中,加入pH3.0的柠檬酸钠盐缓冲溶液12.5mL,1.0mmol/LNaNO2溶液1.25mL,1.0mmol/L二甲胺溶液1.25mL,再用蒸馏水定容至刻度,在37℃下水浴恒温2h。用移液管吸取1.0mL上述含对亚硝胺(NDMA)的反应液加到小试管中,加入0.5%(质量分数)Na2CO3溶液0.5mL,于遮光布遮盖的紫外分析仪上照15min,紫外灯距液面15cm,后加入0.1%(质量分数)对氨基苯磺酸溶液1.5mL,再加0.1%(质量分数)的ɑ-萘胺1.5mL,以及0.5mL蒸馏水,摇匀放置15 min后,用分光光度计在525nm处测吸光光度值(A)。同时分别用相应浓度相同用量的浸提剂做空白试验, 最后计算阻断率:

阻断率= (A0- AX) / A0

A0——加入相应浸提剂空白实验的吸光度值

AX——加入不同浓度浸提液时的吸光度值

按上述方法,另分别取最佳条件的浸提液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL进行阻断NDMA的浓度梯度的测定, 计算每一浓度下的阻断率。

2结果与分析  

2.1提取条件的单因素试验  

2.1.1浸提剂种类对亚硝酸盐清除率的影响 称取簕菜茶研磨粉2.000g于250mL锥形瓶中,分别加入蒸馏水、50%甲醇、50%乙醇作为浸提剂,按料液比1:50在80℃水浴下恒温加热1h,然后过滤得浸提液,每次用移液管抽取提取液2.0mL置于25mL比色管中,用1.2.2方法测定清除率,结果见表2。

表2浸提液种类对亚硝酸钠清除率的影响

Table 2 The effect of extraction type to the scavenging rate of Sodium Nitrite

浸提剂

蒸馏水

50%甲醇

50%乙醇

清除率(%)

40.90

24.31

29.15

由表2可知,由于浸提液种类的不同,浸提液对亚硝酸钠的清除率亦不同,当以蒸馏水为浸提剂的时候清除率达到最大值。

2.1.2浸提时间对清除率的影响 按料液比1:50加入蒸馏水作浸提剂,以80℃水浴分别加热0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h,过滤得浸提液,然后每次用移液管抽取提取液2.0mL置于25mL比色管中,用1.2.2方法测定清除率,结果见表3。

表3浸提时间对亚硝酸钠清除率的影响

Table 3 The effect of extraction time to the scavenging rate of Sodium Nitrite

浸提时间(h)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

清除率(%)

37.30

41.17

41.67

42.36

39.78

由表3可知,随着浸提时间的增加,浸提液对亚硝酸钠的清除率逐渐增加,当浸提时间为2.0h时清除率达到最大值,继续增加提取时间清除率反而减小。

2.1.3料液比对清除率的影响 按料液比1:10、1:25、1:50、1:75、1:100,加入蒸馏水作为浸提剂,以80℃水浴加热2.0h,过滤得浸提液,然后每次用移液管抽取提取液2.0mL置于25mL比色管中,用1.2.2方法测定清除率,结果见表4。

表4浸提剂浓度对亚硝酸钠清除率的影响

Table 4 The effect of solid-solution rate to the scavenging rate of Sodium Nitrite

料液比

1:10

1:25

1:50

1:75

1:100

1:125

清除率(%)

45.06

53.99

42.56

38.91

30.84

26.01

由表4可知,随着料液比的逐渐增加,当料液比为1:25时,浸提液对亚硝酸钠的清除率为最大值。

2.1.4水浴温度对清除率的影响 按料液比1:25的比例,分别以60、70、80、90、100℃加热2.0h,过滤得浸提液,然后每次用移液管抽取提取液2.0mL置于25mL比色管中,用1.2.2方法测定清除率,结果见表5。

表5水浴温度对亚硝酸钠清除率的影响

Table 5 The effect of temperature to the scavenging rate of Sodium Nitrite

温度(℃)

60

70

80

90

100

清除率(%)

40.89

45.74

53.47

57.23

60.10

由表5可知,随着水浴温度的上升,清除率呈正相关也在上升。当水浴温度达到100℃时,浸提液对亚硝酸钠的清除率达到最大。  

2.2最佳浸提工艺条件 从表6可知,对亚硝酸钠清除率为考察指标时,簕菜茶活性物质浸提最佳因素组合为A1B3C3D1,即用蒸馏水作为浸提剂,以1:25的料液比在沸腾回流条件下浸提2.0 h所得的簕菜茶浸提液对清除亚硝酸钠的效果最佳。通过极差R的数值可反映出各因素对结果影响大小的顺序为D>A>C>B,D因素影响最大,B因素影响最小。

表6正交试验设计及结果(以亚硝酸钠清除率作为考察指标)

Table 6 Results of orthogonal test design (Considerthe scavenging rate to Sodium Nitriteas the main factor)  

实验号

A

B

C

D

清除率(%)

1

1

1

1

1

59.09

2

1

2

2

2

42.09

3

1

3

3

3

36.76

4

2

1

2

3

19.56

5

2

2

3

1

46.11

6

2

3

1

2

30.64

7

3

1

3

2

32.83

8

3

2

1

3

23.59

9

3

3

2

1

46.31

K1

0.460

0.372

0.378

0.504

K2

0.321

0.373

0.360

0.352

K3

0.342

0.379

0.386

0.266

R

0.139

0.007

0.026

0.238

根据最优方案的确定方法[15],以不同考察指标理论计算所获得最佳提取条件进行浸提,与已完成的实验组结果进行对比分析。当以亚硝酸钠清除率为考察指标时,由表6通过K值分析确定的最佳浸提条件为A1B3C3D1,该浸提条件下获得的浸提液对亚硝酸钠清除率为59.41%,高于表6中已进行过的实验结果,此时通过实验确定,由K值分析推断的组合A1B3C3D1为亚硝酸钠清除效果最佳的浸提工艺条件组合。

从表7可知以NDMA合成的阻断率为考察指标时,簕菜茶活性物质浸提最佳因素组合为A1B3C3D1,即用蒸馏水以1:25的料液比在沸腾回流条件下浸提2.0h所得的簕菜茶浸提液对阻断NDMA合成的效果最佳。通过极差R的数值可反映出各因素对结果影响大小的顺序为D>A>B>C,D因素影响最大,C因素影响最小。

表7正交试验设计及结果(以NDMA合成的阻断率作为考察指标)

Table 7 Results of orthogonal test design (Consider the disconnecting rate of NDMA formation as the main factor)

实验号

A

B

C

D

阻断率(%)

1

1

1

1

1

84.29

2

1

2

2

2

70.36

3

1

3

3

3

62.57

4

2

1

2

3

45.38

5

2

2

3

1

74.66

6

2

3

1

2

60.64

7

3

1

3

2

62.19

8

3

2

1

3

51.52

9

3

3

2

1

76.77

K1

0.724

0.634

0.654

0.786

K2

0.602

0.655

0.642

0.644

K3

0.635

0.667

0.665

0.532

R

0.122

0.033

0.023

0.254

当以NDMA合成的阻断率为考察指标时,由表7通过K值分析确定的最佳浸提条件为A1B3C3D1,其对NDMA合成的阻断率为86.07%,高于已进行的表7中所有实验组的阻断率。所以认为,以NDMA合成的阻断率为考察指标时,通过实验确定,由K值分析推断的组合A1B3C3D1为阻断NDMA合成效果最佳的浸提工艺条件组合。

2.3不同用量浸提液的清除率与阻断率的效果比较 不同用量的最佳浸提条件(A1B3C3D1)下获得的浸提液清除率与阻断率测定结果如图1所示。由图可见,随着簕菜茶浸提液用量的增多,清除率呈坡度上升至最高值随后平缓下降的过程趋势;阻断率则是波动上升后持续降低。当浸提液用量在0.5~4.5mL时,对亚硝酸钠的清除率从25.81%提高到峰值75.04%,后由75.04%下降到73.19%。该过程最大清除率为75.04%。当浸提液用量在0.5~2.5mL时,阻断率由55.86%迅速升至88.65%,后随着浸提液用量的增加,阻断率持续下降至75.86%,此时浸提液用量为5mL。该过程中最大阻断率为88.65%。  

图1不同用量簕菜茶浸提液的清除率和阻断率(A1B3C3D1条件下浸提所得浸提液)  

Figure 1 Capabilities of scavenging sodium nitrite and disconnecting NDMA

byAcanthopanax trifoliatusTea extracts (underA1B3C3D1condition)

3 结 论

3.1在体外模拟胃液,即pH为3.0,37℃的条件下,簕菜茶浸提液能有效地清除亚硝酸盐和阻断NDMA的生成。通过四因素三水平正交实验,经K值分析以及实验最终获得浸提簕菜茶中活性成分的最佳浸提工艺条件:以对亚硝酸钠清除作用和对NDMA合成的阻断率为考察指标时,浸提簕菜茶中的活性成分的最佳条件都是按料液比为1:25,以蒸馏水在沸腾回流条件下浸提2.0h,此时簕菜茶浸提液对亚硝酸钠的的最大清除率为59.41%;对NDMA合成的最大阻断率为86.07%。在最佳提取工艺条件下,当加样量为4.5mL时清除率可达到75.04%;当加样量为3.0mL时阻断率可达到88.65%。  

3.2簕菜分布于江西、福建、台湾、湖南、广东、广西、贵州和云南等地。除广东恩平外,其他地方的簕菜尚未对其进行增值利用。簕菜茶浸提液能够有效地阻断NDMA的合成和清除亚硝酸盐,作为防癌功能产品开发利用前景可观,能够作为一种经济、高效具有防癌功效的天然生物资源,此研究为簕菜茶的增值利用提供一种可行高效的途径。  

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食品工业科技2013年第11期第34卷


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